Mekanik ve Enzimatik Yöntemlerle İzole Edilen Stromal Vasküler Fraksiyonun Yara İyileşmesi Üzerindeki Etkisinin İn-Vitro Karşılaştırmalı İncelenmesi
Özeti
Arka Plan: Enzimatik sindirim, stromal vasküler fraksiyon (SVF) izolasyonu için altın standart olmuştur, ancak pahalıdır ve pratik ve yasal endişelere yol açmaktadır. Mekanik SVF izolasyon yöntemlerinin daha düşük hücre verimi sağladığı bilinmektedir, ancak hücre dışı matris nişini koruyarak daha sağlam bir ürün üretebilirler.
Amaçlar: Bu çalışmanın amacı, mekanik olarak ayrıştırılmış SVF (M-SVF) ile enzimatik olarak sindirilmiş SVF (E-SVF) arasındaki yara iyileşme etkinliğini karşılaştırmaktı.
Yöntemler: Lipoaspirat, mekanik veya enzimatik izolasyon yöntemlerinden biri ile işlenmek üzere 2 eşit gruba ayrıldı. SVF izolasyonunun ardından, hücre sayıları ve canlılıkları akış sitometrisi ile belirlendi ve hücre proliferasyon oranları WST-1 testi ile ölçüldü. Yara iyileşmesini modellemek için yaygın olarak kullanılan bir in-vitro yara iyileşme çizik testi her iki hücre karışımı ile yapıldı. Ayrıca, kolajen tipi 1 (Col1A) gen ifadesi her iki grup için ölçüldü.
Bulgular: Beklendiği gibi, E-SVF, M-SVF’ye kıyasla daha fazla hücre izole etti, ancak hücre canlılığında anlamlı bir fark gözlemlenmedi. Bununla birlikte, M-SVF, E-SVF ile karşılaştırıldığında, kök hücre yüzey markerlarının 2 kat daha yüksek seviyelerde ifade edilmesi ve %10 daha yüksek proliferasyon oranı gösterdi. Ayrıca, M-SVF’nin göç hızı ve Col1A gen ifadesi seviyesi, E-SVF’ye göre anlamlı derecede daha yüksek bulundu.
Sonuçlar: M-SVF’nin hücre verimi, E-SVF’ye göre daha düşük olsa da, M-SVF’nin üstün yara iyileşme özelliklerine sahip olduğu görülmektedir.
Yara iyileşmesi, anatomik ve fonksiyonel bütünlüğü onarmak ve sürdürmek için evrimleşmiş düzenli ve metodik bir fizyolojik süreçtir. Kronik yaralar, bu süreci geçiremeyen yaralardır ve genellikle diyabet veya obezite gibi altta yatan bir hastalığın bir komorbiditesi olarak görülür.
Yağ dokusu, kemik iliği, periferik kan, kordon kanı ve amnion gibi çeşitli kaynaklardan türetilen kök hücrelerin, hasar görmüş dokuların yara onarımını artırdığı bilinmektedir. Yağdan türetilen stromal vasküler fraksiyon (SVF) gibi heterojen bir hücre popülasyonunun kullanımı, epitelizasyon, anjiyogenez ve immünmodülasyon gibi belirli fizyolojik özelliklere dayanan yara iyileşmesi için en umut verici tedavi stratejilerinden biridir.
SVF, kök hücreler, mezenkimal hücreler, preadipositler, endotel hücreleri, hematopoietik hücreler, fibroblastlar ve perisitleri içerir. SVF elde etmek için geleneksel izolasyon yöntemi, insan lipoaspiratının enzimatik sindirimiyle yapılır ve bu işlem E-SVF’yi verir. Ancak, yağ dokusunun enzimatik sindirimi, FDA ve diğer düzenleyici otoriteler tarafından onaylanmamıştır. Bu nedenlerle, mekanik olarak ayrıştırılmış stromal vasküler fraksiyon (M-SVF) üzerine yapılan araştırmalar başlatılmıştır.
Yöntemler
Bu çalışma Eylül 2019’da başlatılmış ve Ekim 2019’da tamamlanmıştır. On beş ardışık, obez olmayan kadın hasta, tüm cerrahi prosedürler hakkında preoperatif olarak bilgilendirilmiş ve yazılı onam vermiştir.
Her bir hasta için 40 mL lipoaspirat, 2 mm çapında çok delikli bir kanül ile alınmıştır. Dekantasyondan sonra, yağ dokusu mekanik ve enzimatik SVF izolasyonu için 2 eşit parçaya bölünmüştür. Enzimatik izolasyonda GMP dereceli kolajenaz NB6 kullanılmış, mekanik izolasyonda ise Lipocube SVF Kit kullanılmıştır. Hücre sayımları, akış sitometrisi, hücre proliferasyonu testi (WST-1), yara iyileşme çizik testi ve gen ifade analizi yapılmıştır.
Sonuçlar
İzole edilen toplam nükleuslu E-SVF hücre sayısı 1.74 × 10⁶ iken, izole edilen toplam nükleuslu M-SVF hücre sayısı 0.94 × 10⁶ idi. İzolasyon sonrası hücre canlılığı, E-SVF grubunda %96.67, M-SVF grubunda ise %97.55 olarak bulunmuştur.
Tablo 1. Hücre Sayımı ve Hücre Canlılık Sonuçları.
| Viable hücre sayısı/mL (×10⁶) | Hücre canlılığı, % | |
|---|---|---|
| M-SVF | 0.94 | 97.55 |
| E-SVF | 1.74 | 96.67 |
M-SVF’nin ADSC belirteçlerinin fenotipik karakterizasyonu, E-SVF ile karşılaştırıldığında, CD90’da 1.93 kat artış, CD44’te 3.0 kat artış, CD105’te 2.9 kat artış ve CD73’te 1.7 kat artış gözlemlenmiştir.
E-SVF grubunda 72 saat sonra A490 değeri 187 ± 0.3 iken, M-SVF grubunda 201 ± 0.1 olarak ölçülmüştür. M-SVF hücrelerinin proliferasyon hızı, E-SVF grubuna kıyasla 72 saatin sonunda %10-20 daha yüksek bulunmuştur.
Yara iyileşme çizik testinde, allantoin (pozitif kontrol) %98 yara kapanma hızı gösterirken, allantoin olmayan (negatif kontrol) %19 yara kapanma hızı göstermiştir. E-SVF kullanımı %45 yara kapanma hızı, M-SVF kullanımı ise %89 yara kapanma hızı göstermiştir.
Yara iyileşmesinde rolü bilinen kolajen tipi 1 geni, Col1A’nın ifade seviyesi, M-SVF hücre popülasyonlarında E-SVF hücre popülasyonlarına kıyasla 1.5 kat daha yüksekti.
Tartışma
Yara iyileşme hızının ana faktörleri, hücre göçü ve proliferasyonudur. Çalışmamızda, M-SVF hücrelerinin sayısı, E-SVF hücre kokteyllerindekilerin %30 ila %60’ı kadar olmuştur. Ancak mevcut bulgular, M-SVF hücrelerinin kültürleme sonrası hücre proliferasyon hızlarının arttığını ve Col1A gen ekspresyon seviyesini artırdığını göstermektedir. Mekanik izolasyon, sadece daha kolay ve daha hızlı olmakla kalmaz, aynı zamanda cerrahi ortamda rahatça yapılabilmesi nedeniyle enzimatik izolasyona tercih edilmektedir.
Sonuçlar
M-SVF’nin toplam hücre verimi, E-SVF’ye kıyasla daha düşük olsa da, M-SVF’nin fenotipik karakterizasyonu ve Col1A gen ekspresyon seviyesi E-SVF’ye göre anlamlı şekilde daha yüksek bulunmuş ve daha iyi yara iyileşme özellikleri gösterilmiştir. Ön sonuçlarımız, M-SVF’nin cilt yaralarının tedavisinde daha iyi bir alternatif olabileceğini önermektedir.
Dr. Tunç Tiryaki ile Danışmanlık İçin İletişime Geçin
Yara iyileşme tekniklerinde en son gelişmeleri öğrenmek ister misiniz?
Dr. Tunç Tiryaki, stromal vasküler fraksiyon (SVF) izolasyonu ve yara iyileşmesindeki potansiyel uygulamaları hakkında yenilikçi yöntemleri tartışmak için uzman danışmanlık hizmeti sunmaktadır.
